牛呼吸道疾病綜合癥（BRDC）核酸檢測試劑盒（熒光RT-PCR法)
【產品名稱】
商品名稱：牛呼吸道疾病綜合癥（BRDC）核酸檢測試劑盒（熒光RT-PCR法）
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
牛呼吸道綜合癥是由病毒和細菌等多個病因相互作用的多重感染引起的。具體因素有天氣和飼料的改變、畜舍過于擁擠、動物缺乏休息、牛棚不舒適、長途運輸后等。在這種情況下，瘦弱而營養不良的幼畜十分容易患上牛呼吸道綜合征。本試劑盒適用于檢測牛呼吸道分泌物，鼻眼分泌物，肺部等樣本中的牛呼吸道疾病綜合癥RNA，適用于牛呼吸道疾病綜合癥感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒用1對牛呼吸道疾病綜合癥特異性引物，結合1條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術對牛呼吸道疾病綜合癥RNA進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規 格 |
BRDC酶液 | 50μL×1管 |
BRDC反應液 | 950μL×1管 |
BRDC陽性質控品 | 50μL×1管 |
陰性質控品 | 50μL×1管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
取腸內容物和腸系膜淋巴結；待檢活畜，取分泌物和排泄物于離心管中。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1 樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中。
分泌物和排泄物樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 RNA提取
為了使實驗結果穩定、有效、可靠，建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進行提取，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | BRDC反應液 | 酶液 |
用量 | 19μL | 1μL |
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟1提取的RNA、陽性質控品、陰性質控品各取5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）HEX檢測牛呼吸道疾病綜合癥，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環參數設置：
步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 50℃ | 15min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
3 | 45 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結果分析判定
5.1 結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤38.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道38.0<Ct值<40.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現Ct值<40.0且有典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤30；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
8. 性能指標
（1）敏感性：內控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上。最DI檢測限不低于1000copies/ml。
（2）特異性：100%。
（3）穩定性：批內及批間差異≤3%。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
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