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細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書

Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit 

目錄號：K2575   

保存：  -20℃避光保存 

組分說明

Cat.No.                 K2575

KitSize                 50

DyeingBuffer             22.5ml

25×PropidiumIodide，PI     750 μl 

產品簡介 

    細胞周期與凋亡檢測試劑盒是一種采用經典的碘化丙啶染色(Propidiumstaining，即 PIstaining)方法進行細胞周期與細胞凋亡分析的檢測試劑盒。

碘化丙啶(Propidium，簡稱PI)是一種雙鏈DNA 的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈 DNA 結合后可以產生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA 的含量成正比。細胞內的 DNA 被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA 含量測定，然后根據DNA 含量的分布情況，可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。碘化丙啶染色后，假設G0/G1 期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA 的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA 復制的S期細胞的熒光強度為1-2 之間。凋亡細胞由于細胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA*片段化(DNAfragmentation)導致部分基因組 DNA*片斷在染色過程中丟失，因此凋亡細胞碘化丙啶染色后呈現明顯的弱染，即熒光強度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現所謂的sub-G1 峰，即凋亡細胞峰。細胞發(fā)生凋亡時，由于胞漿和染色質濃縮、核碎裂，產生凋亡小體，使細胞的光散射性質發(fā)生變化。在細胞凋亡的早期，細胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側向光散射的能力增加或沒有變化。在細胞凋亡的晚期，前向和側向光散射的信號均降低。因此可通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化觀察細胞凋亡情況。

    本試劑盒通常應用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與細胞凋亡檢測。如果用于組織的細胞周期與細胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細胞狀態(tài)，才可以進行檢測。

    本試劑盒每個樣品的細胞數量可以為10-100 萬。

注意事項 

1.  本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。

2.  需自備PBS、95%乙醇和RNaseA。

3.  熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

4.  PI 對人體有刺激性，請注意適當防護。

5.  請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1. 細胞樣品的準備：

a. 對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內備用。用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1毫升冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。再次加入1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

b. 對于懸浮細胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50 微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，并轉移到1.5 毫升離心管內。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

2. 細胞固定：

  取4 毫升冰浴預冷的95%乙醇，低速渦旋震蕩的同時加入 1 毫升細胞懸液，混勻后 4℃固定 2 小時或更長時間。固定12-24 小時可能效果更佳。1000×g 左右離心 3-5 分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的乙醇，以避免吸走細胞。加入約 5ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的PBS，以避免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

3.PI 染色液的配制：

    參考下表，根據待檢測樣品的數量配制適量的PI 染色液：

         

                     1 個樣品      6 個樣品     12 個樣品 

DyeingBuffer           0.4ml        2.4ml      4.8ml 

25×PropidiumIodide，PI    15μl         90μl     180μl 

RNaseA(10mg/ml，自備)     1μl       6μl      12μl 

注：配制好的PI 染色液短時間內可以4℃保存，宜當日使用。

4. 染色：

    每管細胞樣品中加入400μlPI 染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴 30 分鐘。隨后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24 小時內完成流式檢測，*好能在當日完成流式檢測。

5. 流式檢測和分析：

    用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm 波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA 含量分析和光散射分析。



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