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Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定說明書

更新時間：2019-05-13　點擊量：1839

貨號：YJ2275 規格：50管/24樣

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶活性測定說明書

可見分光光度法

產品說明：

Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機磷。根據Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定ATP 酶活性高低。

需自備的儀器及用品：

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50mL ×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時每支加1mL 蒸餾水，現用現配。用不完的試劑-20℃可保存一周。

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入3mL 蒸餾水， 4℃保存。

試劑七：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水，溶解后4℃保存一周。

試劑八：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水，溶解后4℃保存一周。

試劑九：液體25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑十：10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑十20倍稀釋，即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水

充分混勻

定磷劑的配制：按H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現用現配。

注意：配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

樣品酶液的制備：

細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30 次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟：

分光光度計預熱30min 以上，調節波長至660nm，蒸餾水調零。
酶促反應（在EP 管中加入下列試劑）

	對照管	測定管
試劑一（μL）	130	90
試劑二（μL）	40	40
試劑三（μL）	40	40
試劑四（μL）	40	40
試劑五（μL）		40
樣本（μL）		200
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴10min。
試劑六（μL）	50	50
樣本（μL）	200
混勻，8000g，常溫離心10min，取上清液

定磷（1.5mLEP 管中依次加入下列試劑）

	空白管	標準管	對照管	測定管
0.5μmol/ml 標準磷應用液（μL）		100
上清液（μL）			100	100
蒸餾水（μL）	100
定磷試劑（μL）	1000	1000	1000	1000